Методика амплификации участка синтетической ДНК длиной 547 п.н.

Методика амплификации участка синтетической ДНК длиной 547 п.н. (эксперимент проводил П.Гаряев)
в системе полимеразной цепной реакции с использованием мШЭИ спектров ДНК-продукта, полученных с помощью лазерной установки.

Шаг 1. Получение исходного ДНК-продукта
В качестве исходного ДНК-продукта был взят ПЦР-продукт длиной 547 п.н., для получения которого использовали клонированную в плазмидном векторе синтетическую последовательность.
Плюсовая цепь ДНК:
5′-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATCAATCAACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAA CGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAATGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATG
ATGGCATTTGTAGGAGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTGCGCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGGGGGACTCTAATCATA
AAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATGTTAATTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGACCGGCAA
CAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCACGCATTAATGGACTGGATTGGGGCCAACTCCTACCGTACCTGGCATTACCCTTACGCTGAAGAGATGCTC
GACTGGGCAGATGAACATGGCATCGTGGTGATTGATGAAACTGCTGCTGTCGGCTTTAACCTCTCTTTAGGCATTGGTTTGGAAGCGGGCA-3′

Для ПЦР-амплификации ДНК-продукта использовали пару праймеров:
5′-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATC-3′;
5′-TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCTAAAGA-3′.
Каждая ПЦР-смесь конечным объёмом 25 мкл содержала: 67 мМ трис-HCl pH 8,6 при 25°С; 2,5 мМ хлорид магния; 16,6 мМ сульфат аммония; смесь dNTPs в суммарной концентрации 300 мкМ; смесь праймеров по 0,5 мкМ каждого; 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы и плазмидную ДНК-матрицу в количестве 25 нг. Температурный режим проведения ПЦР включал:
первоначальная денатурация при 94°С — 3 мин.;
30 циклов: 94°С – 30 с, 62°С – 30 с, 72°С – 40 с;
завершающий синтез при 72°С в течение 5 минут.
ПЦР-продукт очищали от праймеров и компонентов ПЦР-реакции с помощью набора для очистки с использованием SiO2-магнитных частиц («Силекс», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Использовали 10 мкл магнитных частиц с ёмкостью связывания 10 мкг ДНК. Элюцию ДНК осуществляли в объёме 50 мкл буфера для элюции.
Шаг 2. Получение мШЭИ спектра ДНК-продукта.
Каплю водного раствора ПЦР-продукта в объёме 25 мкл наносили на чистое предметное стекло и использовали для зондирования лучом гелий-неонового лазера ЛГН-303 от 3 мин. И выше. Получаемое вторичное модулированное широкополосное электромагнитное излучение (мШЭИ) записывали транзисторным радиоприемником на частоте 700 кГц и переводили в звук в формате wave. Этот звуковой файл мы предлагаем использовать для введения ДНК информации (без использования, в данном варианте, лазера ЛГН-303) в образцы стерильной воды, имея в виду, что звук содержит торсионную информацию http://www.efir.com.ua/rus/a.php?r=2&d=69 , в том числе о ДНК (гипотеза). Такой акустико-торсионный вариант квантового клонирования ДНК даём в отдельном файле.
На расстоянии 15-20 см от луча лазера находился штатив с пробирками, содержащими очищенную дистиллированную воду без примесей ДНК, РНК и нуклеаз. Вода была предварительно заморожена при -20°С и разморожена при комнатной температуре (талая вода).
Шаг 3. ПЦР-амплификация с использованием образцов воды, обработанных мШЭИ спектром ДНК-продукта
После воздействия лазера воду, обработанную мШЭИ спектром, использовали для постановки стандартных ПЦР-реакций объёмом 25 мкл без добавления вещественной ДНК-матрицы. Постановку ПЦР-реакций осуществляли в стерильном боксе, обработанном УФ-светом, исключающем контаминацию образцов.
Каждая ПЦР-смесь содержала: 67 мМ трис-HCl pH 8,6 при 25°С; 2,5 мМ хлорид магния; 16,6 мМ сульфат аммония; смесь dNTPs в суммарной концентрации 300 мкМ; смесь праймеров по 0,5 мкМ каждого; 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы. Использовали несколько температурных режимов проведения ПЦР, отличающихся продолжительностью этапа элонгации (синтеза) цепей ДНК при 72°С.
Исходный температурный режим ПЦР включал:
первоначальная денатурация при 94°С – 3 мин.;
40 циклов: 94°С – 30 с, 62°С – 30 с, 72°С – 40 с;
завершающий синтез при 72°С в течение 5 минут.
Модифицированный температурный режим ПЦР включал:
первоначальная денатурация при 94°С – 3 мин.;
40 циклов: 94°С – 30 с, 62°С – 30 с, 72°С – 2-7 мин.;
завершающий синтез при 72°С в течение 5-7 минут.
Все температурные режимы приводили к синтезу ПЦР-продукта заданной длины, но в различной степени. Самое большое количество экспериментальных образцов целевого продукта наблюдалось с использованием 7-минутного синтеза цепей ДНК в каждом из 40 циклов ПЦР.
Шаг 4. Анализ результатов ПЦР
После завершения ПЦР-реакции образцы смешивали с буфером для нанесения на гель, содержащим флуоресцентный краситель SYBR Green I («Силекс», Россия) и анализировали в 1,5 % агарозном геле по стандартной методике проведения гель-электрофореза в однократном ТВЕ-буфере. Результаты анализировали на трансиллюминаторе с длиной УФ-волны 365 нм. Положительными считали образцы, полосы в которых располагались на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля, соответствующего размеру ДНК-фрагмента 547 п.н.
Секвенированию подвергали экспериментальные образцы, образцы положительного контроля ПЦР и образцы исходного ДНК-продукта, с которого производили считывание лазером. Секвенирование показало, что экспериментальные образцы на 99,2-100% идентичны исходной последовательности ДНК-продукта, с которой производили считывание информации лазером.

Вот ссылка на скачивание звукового файла ДНК для ПЦР:

Поделится в соц сетях
admin

Коментарии

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *